从“老鼠药”逆袭成“抗凝传奇”：华法林的前世今生

来源：药渡

撰文：Maskey     编辑：安非他命

华法林是一种救命药物，数百万人使用它来预防中风和心脏病发作。它还用于治疗肺栓塞、心房颤动和深静脉血栓 (DVT)。这款重要药物发现背后的故事很有趣，它始于奶牛的一种神秘疾病。

01
神秘的牛病问题

1900年初，美国和加拿大的奶牛因一种神秘疾病而失血过多造成大量死亡。这成为了奶农们面临的一个很大的问题。他们对牛的死亡感到非常困扰，迫切希望找到发病原因。后来发现，导致牛死亡的原因是摄入了一种叫做甜三叶草（Melilotus alba和 Melilotus officinalis）的作物。当气候潮湿时，甜三叶草干草就会受潮发霉。Penicillium jensi和Penicillium nigricans等真菌会感染干草。食用发霉的甜三叶草的奶牛得病而死。当牛食用发霉的甜三叶草干草时，它们的血液会在15天左右逐渐失去凝血能力，牛会在30至50天内因内出血而死亡。1920年金融衰退期间，由于农民们买不起其他类型的饲料，他们仍继续用发霉的甜三叶草喂牛。

兽医Lee M. Roderick和Frank W. Schofield表明，从饲料中去除发霉的干草并输入新鲜血液可以治疗奶牛的这种疾病^[1]。Roderick比较了健康牛和患有这种不寻常疾病的牛的血液，发现受影响的牛存在凝血缺陷。他将这种疾病称为“血浆凝血酶原缺陷”。他还发现发霉的甜三叶草干草中的出血剂，会导致凝血酶原缺乏。

1933年冬天，一位名叫Ed Carlson的农民长途跋涉200英里来到麦迪逊寻找兽医，了解他的奶牛死亡的原因。他去了麦迪逊当地的农业实验站。那是一个星期六，大多数办公室都关门了，一个实验室仍然开放。他走进实验室，向Karl Paul Link教授和他的学生助理做了自我介绍。他给他们看了那头死牛、一堆干草和他带来的一罐未凝结的牛血。Link从明尼苏达大学Ross A. Gortner教授那里了解到了甜三叶草病。他告诉卡尔森，他的奶牛正死于甜三叶草病，并建议不要给他的奶牛喂发霉的干草。

02
止血剂的分离

Link想要找到导致牛死亡的活性化合物。1940年，Link的学生Harold A. Campbell分离出6毫克结晶物质，该物质是香豆素与湿三叶草干草上的霉菌反应形成的。香豆素是干草中存在的一种天然物质，会产生甜三叶草特有的气味。当它被引起霉菌的真菌氧化时，它变成了血液稀释剂。Campbell饲养了一个实验兔群，并向它们喂食分离的浓缩物 ^[2]。他还抽取了兔群的血液，来评估止血剂的抗凝效力。随后，他确定了止血剂的化学式为C₁₉H₁₂O₆。

Link的另一位学生Mark A. Stahmann分离出1.8克抗凝化合物。Stahmann和Charles F. Huebner致力于确定止血剂的化学结构。他们进行降解实验，发现以香豆素为原料生产的止血剂，其化学结构为3,3′-methylene-bis(4-hydroxycoumarin)^[3]。这种止血剂也称为双香豆素。甜三叶草中的香豆素被氧化为4-羟基香豆素，然后与甲醛偶联形成双香豆素^[4]。他们还在实验室合成了一种与发霉的甜三叶草中天然存在的双香豆素相同的化合物。

图1. 双香豆醇的形成，来源：文献4

几年后，科学家发现维生素K缺乏会导致动物出血^[5]。缺乏维生素K的动物也缺乏凝血酶原。Link了解到维生素K和双香豆素的结构相似。当动物摄入双香豆素时，它会破坏凝血酶原的形成并导致出血。维生素K充当拮抗剂并逆转双香豆素的这种作用^[6]。

图2. 华法林、维生素K、香豆素和双香豆素的结构，来源：文献6

03
华法林的合成

Link认为香豆素的衍生物可以用作杀鼠剂。他和他的团队合成了大约150种抗凝血化合物的变种。他们决定使用标记为42号的化合物的最强变种作为老鼠药，并于1952 年获得批准。这种变种的效力比双香豆素更强，但Link认为这种变种毒性很大，因此不想为其申请专利。

Stahmann在WARF（威斯康星校友研究基金会）的支持下申请了该变种的专利。他们以“华法林”的名义出售老鼠药。他以WARF的名字命名了该药物，该基金会为他的研究提供了资金。华法林中的“-arin”来自香豆素（coumarin）。华法林可以杀死老鼠，但对猫和狗等大型动物毒性不大。

图3. Link推广使用华法林灭鼠，图源：文献1

04
偶然发现其对人体无毒性

1951年，一名22岁的美国男子对自己入伍感到悲伤。他试图服食老鼠药自杀^[7]。起初，他吃了一小部分粉末状的毒药。他说它尝起来像棉花糖，并且没有引起任何不适的症状。他继续每天服用相同剂量的华法林，并在六天内服用了113克毒药，随后他因背痛和腹痛入院。在入院之前，他经历了鼻子流血的情况，他的病情比较稳定。其接受了新鲜全血的输注，医生还给他注射了维生素K以对抗华法林的影响。这一事件让科学家们知道，华法林虽然对老鼠致命，但不会对人类造成重大伤害。

Link和他的团队了解到，华法林可以安全地用作治疗性抗凝剂，可以治疗人类危险的血栓。华法林的主要优点是易溶于水，口服生物利用度高。肝素当时被用作抗凝剂，但只能通过肠胃外途径给药。1941 年，威斯康星综合医院和梅奥诊所进行了双香豆素的人体试验。华法林于1954年被批准用于人体，商品名为“Coumadin”。一年后的 1955年，艾森豪威尔总统因心脏病发作而服用了这种药物，这款药物帮助他顺利康复。这一消息让人们相信华法林治疗血栓是安全有效的。

05
华法林的生化作用机制

医生广泛将其用于治疗血栓栓塞性疾病，但他们并不了解其确切的生化作用机制。其作用机制由John W. Suttie及其同事于1978年发现^[8]。他们发现华法林通过阻碍环氧化物还原酶的作用，来中断体内维生素K的代谢。使用华法林治疗导致了凝血酶原时间（PT）测试的发展，用于调节该药物的剂量^[9]。世界卫生组织（WHO）于1982年采用了从凝血酶原比值（PTR）获得国际标准化比值（INR）的模型。华法林还导致了凝血因子VII、IX和X等凝血因子的发现。华法林治疗的缺点包括：起效及作用清除慢、治疗指数窄以及不同个体抗凝效果存在差异。该药会引起出血、脱发、皮肤坏死等不良反应^[10]。

总而言之，华法林是在1933年被发现的。Link和他的同事致力于在发霉的甜三叶草干草中寻找抗凝血化合物。他们分离出双香豆素，后来开发出比双香豆素更有效的华法林。自发现以来，华法林已挽救了数百万人的生命，至今仍用于治疗患有血栓的患者。

参考文献（可上下滑动）：

[1] Wardrop, D., & Keeling, D. (2008). The story of the discovery of heparin and warfarin. British Journal of Haematology, 141(6), 757–763. https://doi.org/10.1111/j.1365-2141.2008.07119.x

[2] Nisar, T., Sutherland-Foggio, H., & Husar, W. (2020). Rural origins of warfarin.The Lancet Neurology, 19(1), 35.

[3] The invention of warfarin. American Chemical Society. (n.d.). https:// www.acs.org/education/whatischemistry/landmarks/warfarin.html#:~:text=Mark%20A.,a%20UW-Madison%20biochemistry%20laboratory.&text=Warfarin%20tablets

[4] Link, K. P. (1959). The discovery of dicumarol and its sequels.Circulation, 19(1), 97-107.

[5] Kresge, N., Simoni, R. D., & Hill, R. L. (2005). Hemorrhagic sweet clover disease, dicumarol, and warfarin: the work of Karl Paul Link.Journal of Biological Chemistry, 280(8), e6-e7.

[6] Doolittle, R. F. (2016). Some important milestones in the field of blood clotting.Journal of Innate Immunity, 8(1), 23-29.

[7] Holmes, R. W. (1952). Suicide attempt with warfarin, a BISHYDROXYCOUMARIN-like Rodenticide. JAMA: The Journal of the American Medical Association, 148(11), 935. https://doi.org/10.1001/jama.1952.62930110003013a

[8] Lim, G. B. (2017). Warfarin: From rat poison to clinical use. Nature Reviews Cardiology. https://doi.org/10.1038/nrcardio.2017.172

[9] Francis, C. W. (2008). Warfarin: an historical perspective.ASH Education Program Book, 2008(1), 251-251.

[10]Pirmohamed, M. (2006). Warfarin: almost 60 years old and still causing problems. British journal of clinical pharmacology, 62(5), 509.

*声明：本文仅是介绍医药疾病领域研究进展或简述研究概况或分享医药相关讯息，并非也不会进行治疗或诊断方案推荐，也不对相关投资构成任何建议。